絲素蛋白納米羥磷灰石支架的實(shí)驗(yàn)研究

應(yīng)用共混法制備了納米羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合支架材料,通過體外降解和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究了復(fù)合支架材料的降解特性和生物相容性.體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)合支架材料具有穩(wěn)定的降解能力;在降解過程中,羥基磷灰石由于與降解液發(fā)生鈣、磷等離子的交換,使其結(jié)晶得到了進(jìn)一步生長和完善.利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽(mtt)比色法和堿性磷酸酶(alp)活性測(cè)定等分析了復(fù)合支架材料的生物相容性,結(jié)果表明,mg63細(xì)胞在復(fù)合支架材料上具有良好的粘附、增殖能力,并可引起早期的骨分化.因此,納米羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合支架作為骨組織工程的支架材料具有良好的應(yīng)用前景。

為了探討絲素蛋白/羥基磷灰石(sf/ha)復(fù)合多孔支架材料的制備及其用于骨缺損的修復(fù),采用超聲波凝膠干燥法制備了sf/ha復(fù)合材料;以脫膠繭絲為增強(qiáng)材料,水溶性淀粉為制孔劑,通過去離子水萃取法除去淀粉,制備了sf/ha多孔復(fù)合材料。對(duì)其孔隙率及抗壓強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試,并將其植入兔股骨缺損處觀察修復(fù)的情況。sf/ha多孔復(fù)合材料的孔隙率接近75%,孔徑尺寸分布約從幾微米到400μm,并且孔隙之間相互貫通,其抗壓強(qiáng)度可達(dá)10mpa以上,植入兔股骨缺損處未見引起骨組織明顯的炎癥反應(yīng)及骨壞死,術(shù)后12周發(fā)現(xiàn)基本修復(fù)骨缺損部位,而空白對(duì)照組沒有骨生成。sf/ha多孔復(fù)合材料可以滿足骨組織工程支架的基本要求,用于骨缺損的修復(fù)。

以蠶絲絲素蛋白(sf)作為羥基磷灰石(ha)沉積的模板,制備ha/sf復(fù)合粉末,用掃描電鏡(sem)、熱重分析(tga)、x射線衍射(xrd)和傅立葉變換紅外光譜(ft-ir)對(duì)復(fù)合粉末進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果表明,合成產(chǎn)物是ha/sf復(fù)合物,其平均粒徑約為275.7nm,其中絲素蛋白含量為17.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。復(fù)合粉末經(jīng)等靜壓成型后能夠制得彎曲和壓縮強(qiáng)度分別為19.87mpa和28.65mpa的ha/sf復(fù)合材料,以nacl為致孔劑能夠制得平均孔徑約為61μm、孔隙率為40%的多孔ha/sf復(fù)合材料。

再生絲素蛋白具有良好的生物相容性,羥基磷灰石同時(shí)還具有成骨誘導(dǎo)性。通過將再生絲素蛋白制備形成絲素蛋白多孔材料,并在37℃下將其浸漬于模擬體液中可以制備再生絲素蛋白/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料。掃描電鏡研究發(fā)現(xiàn)在再生絲素蛋白多孔材料的孔隙中羥基磷灰石由針狀晶體聚集而成,紅外光譜和xrd等表征表明復(fù)合材料中羥基磷灰石以羰基取代的羥基磷灰石存在。制備的再生絲素蛋白/羥基磷灰石多孔材料有望作為骨組織修復(fù)材料使用。

利用氯化鈣-乙醇-水(n(cacl_2):n(etoh):n(h_2o)=1:2:8)三元溶液對(duì)絲素蛋白纖維預(yù)處理,再采用交替浸漬法將其分別浸在鈣溶液和磷溶液中交替浸漬、仿生礦化制備絲素蛋白纖維/磷灰石復(fù)合材料,采用sem、ftir、xrd和tga等技術(shù)研究了不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)絲素蛋白纖維微結(jié)構(gòu)和構(gòu)建絲素蛋白纖維/磷灰石的影響.結(jié)果表明,預(yù)處理增加了絲素蛋白纖維表面粗糙程度及內(nèi)部孔隙率,并使鈣離子與絲素蛋白纖維中的羧基、羥基和酰胺基等基團(tuán)先發(fā)生作用,可以有效地提高磷灰石在絲素蛋白表面的沉積量,使得預(yù)處理后的絲素蛋白纖維與磷灰石的結(jié)合更均勻、密實(shí),獲得了磷灰石晶體沿c軸取向生長的仿骨結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料.

目的評(píng)價(jià)絲素蛋白-羥基磷灰石類骨質(zhì)復(fù)合生物材料的生物相容性。方法體外研究將成骨樣細(xì)胞株mg-63細(xì)胞與不同材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng),利用倒置顯微鏡、四甲基偶氮唑鹽比色(mtt)法進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià);體內(nèi)研究將不同材料植入新西蘭大白兔股骨髓腔,分別在4周、8周取出標(biāo)本,he、新三色染色后觀察新骨生成情況。結(jié)果在體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中絲素蛋白-羥基磷灰石類骨質(zhì)復(fù)合生物材料組均顯示出良好的生物相容性。結(jié)論絲素蛋白-羥基磷灰石復(fù)合生物材料具有良好的生物相容性,為新型骨替代材料的制備及應(yīng)用提供新的思路。

為了改善羥基磷灰石(hap)的脆性和新骨誘導(dǎo)性,采用共沉淀法合成hap,鹽溶法制備絲素蛋白(sf),在膠體狀態(tài)下將hap和sf復(fù)合得到了sf/hap復(fù)合材料。采用掃描電鏡(sem)、x射線衍射(xrd),傅立葉紅外光譜(fir)對(duì)復(fù)合材料結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成進(jìn)行了分析,在模擬體液中檢驗(yàn)了復(fù)合材料的生物活性,并對(duì)其抗壓強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明:hap與sf在納米尺度進(jìn)行了復(fù)合,復(fù)合材料中sf主要以β-折疊構(gòu)象存在,酰胺ⅴ紅外特征峰消失,β-折疊構(gòu)象的其他峰發(fā)生了移動(dòng),表明hap與sf間存在化學(xué)結(jié)合;模擬體液中浸泡18天后,復(fù)合材料表面形成了片層狀的hap;與純的hap晶體比較,復(fù)合材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,具有較好生物活性和骨誘導(dǎo)性,其抗壓強(qiáng)度可達(dá)63mpa,可望成為理想的骨組織替換和工程支架材料。

通過靜電紡絲法制備出納米羥基磷灰石/絲素蛋白/聚己內(nèi)酯復(fù)合超細(xì)纖維,利用掃描電鏡、紅外光譜儀、x射線衍射儀對(duì)納米羥基磷灰石/絲素蛋白/聚己內(nèi)酯復(fù)合超細(xì)纖維形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,并進(jìn)行了拉伸測(cè)試。結(jié)果表明,隨著超細(xì)纖維中羥基磷灰石含量的增加,纖維的直徑逐漸降低,纖維中聚己內(nèi)酯的結(jié)晶逐漸變差。相比于絲素蛋白/聚己內(nèi)酯超細(xì)纖維,含有質(zhì)量比為30%羥基磷灰石的復(fù)合超細(xì)纖維仍具有較好的力學(xué)性能。體外小鼠成纖維細(xì)胞(l929)培養(yǎng)表明,納米羥基磷灰石/絲素蛋白/聚己內(nèi)酯復(fù)合超細(xì)纖維對(duì)細(xì)胞沒有毒性。

采用硝酸鈣-絲素蛋白溶液與磷酸鈉原位合成納米羥基磷灰石(ha),在反應(yīng)過程中絲蛋白(sf)誘導(dǎo)ha晶體生長,仿生合成ha/sf復(fù)合材料,用tem、ir、tga、xrd和sem進(jìn)行表征。結(jié)果表明,ha為co23-部分替代型,粒徑為10nm~40nm之間的弱結(jié)晶類骨晶體,在形貌和結(jié)晶度等方面與人體骨磷灰石相似。ha/sf復(fù)合材料中絲蛋白的含量約為25%,ha和sf兩相存在強(qiáng)烈化學(xué)鍵合作用。sem觀察結(jié)果表明,ha微粒被sf完全包裹,兩者之間沒有明顯相分離。

目的比較復(fù)合不同劑量血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨(nhac)修復(fù)骨缺損的效果。方法將納米羥基磷灰石粉末和膠原蛋白粉末按8∶2的比例混合制備nhac人工骨,再將混合粉末與含10ng、100ng、300ngvegf的蒸餾水按1∶1.8的質(zhì)量比調(diào)和制備nhac/vegf人工骨。建立大鼠雙側(cè)橈骨0.5cm缺損動(dòng)物模型30只,按隨機(jī)原則分為5組。以nhac/10ngvegf、nhac/100ngvegf、nhac/300ngvegf人工骨植入骨缺損處進(jìn)行修復(fù)作為實(shí)驗(yàn)組,以nhac人工骨植入組及空白組作為對(duì)照組。術(shù)后2、4、8周各組行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查,觀察材料早期血管化及成骨情況。結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)評(píng)分以及血管計(jì)數(shù)均為nhac/300ngvegf人工骨組最高,于其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組血管數(shù)量在4周時(shí)達(dá)到高峰,而nhac組血管數(shù)量在8周時(shí)最多。結(jié)論血管內(nèi)皮生長因子能明顯促進(jìn)nhac早期血管化及新骨形成,比單純應(yīng)用nhac能更好的修復(fù)骨缺損,并且隨著vegf劑量的增加,新生血管數(shù)量和新骨形成量均相應(yīng)增加。

目的:探討納米羥基磷灰石復(fù)合重組人骨形成蛋白-2人工骨(nano-ha/rhbmp-2)的骨缺損修復(fù)能力,為臨床骨缺損修復(fù)提供依據(jù)。方法:采用新西蘭大白兔75只,單側(cè)橈骨制備骨缺損動(dòng)物模型,以nano-ha/rhbmp-2復(fù)合人工骨植入骨缺損處進(jìn)行修復(fù)作為實(shí)驗(yàn)組(a組),以nano-ha人工骨(b組)及空白組(c組)作為對(duì)照組;術(shù)后4周、8周、12周分別行大體標(biāo)本觀察、x線、掃描電鏡(sem)、放射性核素骨掃描(ect)及生物力學(xué)測(cè)試,綜合評(píng)價(jià)nano-ha/rhbmp-2復(fù)合人工骨對(duì)骨缺損的修復(fù)能力及對(duì)機(jī)體的影響。結(jié)果:nano-ha/rhbmp-2復(fù)合人工骨、nano-ha人工骨均可促進(jìn)新骨形成,前者新骨形成量大,骨缺損修復(fù)能力明顯優(yōu)于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)論:nano-ha/rhbmp-2復(fù)合人工骨具有良好的骨缺損修復(fù)能力,可望成為一種理想的骨缺損修復(fù)材料。

系統(tǒng)分析了羥基磷灰石(ha)的制備方法和絲素蛋白纖維(sf)的溶解方法,提出一種制備納米絲素蛋白/羥基磷灰石生物復(fù)合材料(sf/ha)的新型反應(yīng)復(fù)合方法——"一步法"。并對(duì)由"一步法"制得的sf/ha分別進(jìn)行了鈣磷比測(cè)定、紅外光譜測(cè)試、透射電鏡觀察和x射線衍射測(cè)試。結(jié)果表明:sf/ha中的鈣磷比是1.6692,與標(biāo)準(zhǔn)ha中的鈣磷比1.67一致;sf/ha中同時(shí)含有sf和ha中各自的官能團(tuán);sf/ha的晶粒橫向尺度小于100nm,sf/ha呈針狀或柱狀晶粒,sf和ha能夠形成復(fù)合;sf/ha的晶型屬于六方晶系,當(dāng)sf在sf/ha中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí),晶胞參數(shù)a=b=9.0319,c=7.0148,沿c軸方向平均晶粒尺寸是230.7645。"一步法"制備sf/ha具有合理性和可行性。

羥基磷灰石(ha)是骨組織中無機(jī)物的主要成分。利用絲膠蛋白(ss)良好的生物相容性、生物降解性、細(xì)胞相容性,以及含有的羧基和羥基能與ca2+緊密結(jié)合的特點(diǎn),將氫氧化鈣和磷酸以濕法合成的羥基磷灰石按一定的比例加入到濃縮后的絲膠蛋白溶液中,經(jīng)冷凍干燥制備成絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料,期望用于骨替代和骨缺損修復(fù)。對(duì)絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料進(jìn)行掃描電鏡(sem)、x射線衍射(xrd)、紅外吸收光譜(ftir)、熱力學(xué)性能以及力學(xué)性能等檢測(cè),并探討不同原料配比對(duì)材料結(jié)構(gòu)與性能的影響。結(jié)果表明,絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的孔隙分散均勻,孔隙率33.0%～62.5%;支架材料中的ha呈弱結(jié)晶態(tài),與人體骨組織中ha的晶體態(tài)相似,絲膠蛋白分子呈β折疊結(jié)構(gòu);隨著復(fù)合支架材料中ha的比例不斷增加,材料的熱分解溫度提高,熱學(xué)性能改善,當(dāng)ha的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí),彈性模量增大到15.64mpa,呈現(xiàn)較好的結(jié)構(gòu)性能。

提出了一種制備ha/sf復(fù)合粉末的新方法.以磷酸氫二鈉、無水氯化鈣和絲素蛋白為原料制備羥基磷灰石/絲素蛋白(ha/sf)復(fù)合粉末,通過x-射線衍射(xrd)、掃描電子顯微鏡(sem)和紅外吸收光譜(fir)等檢測(cè)手段,探討了反應(yīng)酸度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間,絲素蛋白加入量和原料加入順序?qū)χ苽鋒a/sf復(fù)合粉末的影響,確定了最佳的制備條件;該方法可降低溶解絲素蛋白的溫度,達(dá)到節(jié)約能源的目的.

以飽和ca(oh)2上清液、磷酸和膠原蛋白為原料,在36～39℃、ph=8～9條件下,用共滴定法制備納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合支架材料。用xrd、sem、tem、ir對(duì)材料的晶相結(jié)構(gòu)、結(jié)晶程度、化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)、微觀形貌、晶粒大小進(jìn)行分析。結(jié)果表明:復(fù)合材料由低結(jié)晶度的納米羥基磷灰石(5nm×60nm～20nm×100nm)和膠原蛋白纖維組成,二者之間形成了緊密鍵合。

納米羥基磷灰石復(fù)合材料是一種新型骨組織替代或修復(fù)材料。介紹了羥基磷灰石的特性、合成方法，總結(jié)了改性研究及應(yīng)用，闡述了納米羥基磷灰石復(fù)合材料生物相容性。

本文以氫氧化鈣懸浮液和磷酸為主要實(shí)驗(yàn)原料,在室溫25℃,ph值為11的條件下,用共滴定的方法合成羥基磷灰石。把羥基磷灰石粉與一定量的膠原蛋白溶液混合,經(jīng)過物理發(fā)泡、冷凍、微波干燥的過程,得到羥基磷灰石/膠原蛋白多孔支架材料。運(yùn)用xrd、sem分析儀器和阿基米德原理及杠桿原理,對(duì)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明用物理發(fā)泡法制得的多孔支架材料的總氣孔率為79%～89%,抗壓強(qiáng)度為0.3～1.1mpa。

由納米羥基磷灰石(ha)與絲素蛋白(sf)復(fù)合而成的新型生物復(fù)合材料,具有優(yōu)良的生物相容性,已被研究用作骨移植及填充材料,但其由絲素蛋白分子內(nèi)交聯(lián)導(dǎo)致的較差的力學(xué)性能,限制了該復(fù)合材料的應(yīng)用。本研究中,采用一種名為聚乙二醇二縮水甘油醚(pgde)的交聯(lián)劑對(duì)復(fù)合材料中的絲素蛋白進(jìn)行改性。該改性的復(fù)合材料經(jīng)過一系列的檢測(cè),結(jié)果顯示交聯(lián)劑pgde可以提高絲素蛋白的結(jié)晶性,復(fù)合材料ha/sf的抗壓強(qiáng)度提高了100%,且該交聯(lián)劑并沒有影響復(fù)合材料的生物相容性。

近年來,隨著組織工程的深入研究,骨組織工程受到學(xué)者越來越多的重視。目前,骨組織工程的研究重點(diǎn)集中在支架材料、種子細(xì)胞、骨構(gòu)建的相關(guān)生長因子等三個(gè)方面。納米羥基磷灰石(nanohydroxyaptite,nhap)屬于陶瓷類材料,有利于人體骨組織的修復(fù)、整合及改善植入組織的力學(xué)性能,因其優(yōu)良的生物性能而備受關(guān)注,nhap已作為骨

目的探討多聚蛋白多糖(aggrecan)過表達(dá)載體修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)來源外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對(duì)新西蘭大白兔軟骨缺損的修復(fù)作用。方法培養(yǎng)兔源性bmscs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)第2代bmscs表面蛋白cd44、cd29、cd34和cd45表達(dá)。慢病毒aggrecan過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bmscs,超速離心法提取外泌體,westernblot方法檢測(cè)外泌體分子標(biāo)志物cd81和cd63的表達(dá)。構(gòu)建絲素蛋白支架聯(lián)合外泌體復(fù)合物,利用掃描電鏡技術(shù)檢測(cè)絲蛋白支架的結(jié)構(gòu)。利用蘇木精-伊紅(he)染色和番紅-快綠染色檢測(cè)新西蘭大白兔軟骨缺損模型中軟骨結(jié)構(gòu)。結(jié)果第2代bmscs表面蛋白cd44和cd29表達(dá)分別為60.2%和58.3%,cd34和cd45表達(dá)分別為3.4%和2.6%。慢病毒aggrecan過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率為(95±2)%。掃描電鏡觀察顯示,外泌體為直徑40～100nm雙層膜的膜狀結(jié)構(gòu)。westernblot檢測(cè)顯示,外泌體可以表達(dá)分子標(biāo)志物cd81和cd63。he染色和番紅-快綠染色結(jié)果顯示,aggrecan過表達(dá)載體修飾bmscs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對(duì)軟骨缺損的修復(fù)作用明顯優(yōu)于bmsc組和陰性對(duì)照組(f=19.298、12.548,p<0.05)。結(jié)論aggrecan過表達(dá)載體修飾bmscs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對(duì)軟骨缺損的修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用,可為骨性關(guān)節(jié)炎治療提供新的思路與方法。

采用化學(xué)沉淀法合成了絲膠蛋白(ss)/羥基磷灰石(hap)復(fù)合材料,并研究了礦化時(shí)間對(duì)復(fù)合材料的影響.x射線衍射(xrd)、傅里葉變換紅外光譜(ftir)、透射電鏡(tem/hrtem)和掃描電鏡(sem)表征結(jié)果表明:在較短的礦化時(shí)間內(nèi),合成的ss/hap為直徑約20nm的復(fù)合顆粒;隨著礦化時(shí)間的延長,這些復(fù)合顆粒能夠沿軸方向組裝并融合成類牙釉結(jié)構(gòu)的較大晶體.文章討論了其可能的組裝機(jī)制.

隨著骨組織工程學(xué)研究的逐步深入,人工骨移植材料的研究得到全新的發(fā)展。骨組織工程應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的價(jià)值己被人們接受,其中支架材料研究是骨組織工程的核心內(nèi)容和中心環(huán)節(jié)。羥基磷灰石(ha)是公認(rèn)的性能良好的人工骨材料,大量的生物相容性實(shí)驗(yàn)證明羥基磷灰石無毒、無刺激、不破壞生物組織,并能與骨形成牢固的化學(xué)結(jié)合具有很好的生物