MALDI-TOF-MS

分子量測(cè)定

分子量是有機(jī)化合物最基本的理化性質(zhì)參數(shù)【35】。分子量正確與否往往代表著所測(cè)定的有機(jī)化合 物及生物大分子的結(jié)構(gòu)正確與否。MALDI-TOF是一種軟電離技術(shù)，不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的碎片離子。它可直接應(yīng)用于混合物的分析，也可用來(lái)檢測(cè)樣品中是否含有雜質(zhì)及雜質(zhì)的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白質(zhì)等鑒定中首要的參數(shù)，也是基因工程產(chǎn)品報(bào)批的重要數(shù)據(jù)之一。MALDI-TOF的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%~0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，目前可測(cè)定生物大分子的分子量高達(dá)600KDa。

質(zhì)譜技術(shù)PMF

蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。對(duì)蛋白質(zhì)快速、準(zhǔn)確的鑒定 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必不可少的關(guān)鍵性的一步。采用MALDI-TOF-MS測(cè)得肽質(zhì)量指紋譜(PMF)在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢識(shí)別的方式鑒定蛋白質(zhì)，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最普遍應(yīng)用的最主要的鑒定方法。肽質(zhì)量指紋譜(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)是蛋白質(zhì)被識(shí)別特異酶切位點(diǎn)的蛋白酶水解后得到的肽片段的質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu))都不同，當(dāng)?shù)鞍妆凰夂?，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，因此其肽質(zhì)量指紋圖也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時(shí)，能耐受適量的緩沖劑、鹽，而且各個(gè)肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進(jìn)行分析PMF的首選方法。在我們關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實(shí)際工作中，幾乎所有的發(fā)現(xiàn)均是從這一步開(kāi)始做起來(lái)的!

質(zhì)譜技術(shù)PSD

由于PMF鑒定結(jié)果的可靠性受諸多因素影響，使得部分鑒定結(jié)果往往不是十分明確，特異性不高。多肽氨基酸序列匹配被認(rèn)為是特異性最好的鑒定方法。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，利用質(zhì)譜測(cè)序一般采用兩種方式:一種是利用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)測(cè)序;另一種是利用源后衰變(post-source decay，PSD)技術(shù)測(cè)序。

在反射式MALDI-TOF-MS中，當(dāng)脈沖激光照射到微量樣品與飽和小分子基質(zhì)混合形成的共結(jié)晶上時(shí)，能量通過(guò)基質(zhì)傳遞給樣品，導(dǎo)致樣品被解析電離，電離后形成的亞穩(wěn)分子離子在飛經(jīng)無(wú)場(chǎng)區(qū)(即飛行管區(qū))時(shí)發(fā)生裂解(其活化能來(lái)自在離子源與基體發(fā)生的碰撞，在無(wú)場(chǎng)區(qū)與殘留氣體的碰撞，激光輻射及各種熱機(jī)制等)所產(chǎn)生的子離子(即源后分解碎片離子)，可以通過(guò)不斷改變反射器電壓來(lái)進(jìn)行分離、收集并記錄于檢測(cè)器，形成能為多肽和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)提供十分豐富而有效的結(jié)構(gòu)信息的PSD質(zhì)譜圖。利用PSD譜圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以迅速、高特異性地鑒定蛋白質(zhì)。

目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，部分經(jīng)2DE分離的蛋白質(zhì)樣品無(wú)法通過(guò)PMF鑒定或鑒定結(jié)果不明確，可將PSD測(cè)序功能應(yīng)用于這些蛋白質(zhì)的鑒定。隨著對(duì)PSD技術(shù)的不斷研究和發(fā)展，尤其是結(jié)合MALDI-TOF-MS本身所具有的高靈敏度、高通量、樣品靶點(diǎn)可多次應(yīng)用測(cè)定、分析時(shí)主要產(chǎn)生單電荷準(zhǔn)分子離子以及能夠耐受一定量的鹽和干擾物等特點(diǎn)，PSD-MALDI-TOF-MS將會(huì)在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及藥物篩選的研究中發(fā)揮更大的作用。

寡核苷酸的分析

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和反義核酸藥物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的寡核苷酸片段被合成，用以作引物、探針以及反義藥物等。對(duì)這些片段進(jìn)行快速檢測(cè)，以判斷合成的是否完全及合成的序列是否正確，是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在內(nèi)的生物質(zhì)譜是迄今為止進(jìn)行這種檢測(cè)最好的手段。用MALDI-TOF-MS測(cè)定分析寡核苷酸，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏。結(jié)合3'-外切酶和5'-外切酶可以對(duì)寡核苷酸全序列進(jìn)行測(cè)定。

儀器(如圖1)主要由兩部分組成:基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI) 和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比 ，檢測(cè)離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，并正扮演著越來(lái)越重要的作用。

早期的MALDI一TOF 盡管能夠分析質(zhì)量數(shù)達(dá)數(shù)萬(wàn)的大分子, 但是它只有數(shù)百的分辨率,質(zhì)譜峰較寬,信噪 比不理想, 質(zhì)量測(cè)量精度不高。對(duì)于 MALDI一TOF, 影響分辨率的主要因素是初始離子的動(dòng)能分散。 這已在 Chait 等人的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí) 。目前主要有兩個(gè)措施來(lái)解決這個(gè)問(wèn) 題: ① 靜電反射器 ( ElectrostaticReflec tron), 這個(gè)概念最早由 Manlyrin 于 1973 年提出,其基本原理是當(dāng)離子源飛向反射器時(shí).高動(dòng)能的離子會(huì)比低動(dòng)能的離子更深的穿入反射器。 離子被反射后, 飛抵離子檢測(cè)器, 高動(dòng)能的離子飛行的路程就長(zhǎng)一 些。 調(diào)節(jié)反射器條件就可以使得質(zhì)量相同而初始動(dòng)能不同的離子更加一致地達(dá)到檢測(cè)器, 實(shí)現(xiàn)動(dòng)能的一級(jí)聚焦。Mamyrin于 1994 年 又提出了對(duì)離子進(jìn)行高次聚集的設(shè)計(jì)方案。Cotetr 用十分簡(jiǎn) 單的圓筒電極作為反射器實(shí)現(xiàn)了 Mamyrin 的設(shè)想 。反射器可以使MALDI 一TOF 的分辨率大大提高。②離子延遲引出 ( Delay Extraction) , 當(dāng)激光照射靶的瞬間, 若靶電極和與其相對(duì)的離子引出電極處于相同的電位, 即在兩電極之間形成無(wú)場(chǎng)區(qū), 那么被解吸離子以不同的初始速度在無(wú)場(chǎng)區(qū)內(nèi)運(yùn)動(dòng), 經(jīng)過(guò)一 段延遲時(shí)間后, 速度高的離子離靶遠(yuǎn),速度低的離子離靶近, 然后以脈沖方式在瞬間使靶與引出電極處于不同電位, 由此產(chǎn)生的電場(chǎng)把離子引出, 經(jīng)聚焦透鏡后飛出離子源。 離靶近的離子比離靶遠(yuǎn)的離子得到更大的加速 ( 因而獲得更大的動(dòng)能 ), 適當(dāng)選擇延遲時(shí)間及靶與引出電極間電壓差, 可以有效地補(bǔ)償離子的初始動(dòng)能分散, 從而顯著地提高線性 TOF 質(zhì)譜儀的分辨率, 飛行距離約 1 m 的線性TOF質(zhì)譜儀的分辨率可達(dá) 2000-3000。 這一技術(shù)即為 "延遲引出" (Delay Extraction) 技術(shù)或稱為" 脈沖離子引出"( PulseIon Extraction, PIE )。 延遲引出技術(shù)與離子反射器聯(lián)合用可使 MALDI一TOF 質(zhì)譜儀的分辨率超過(guò)一 萬(wàn)。