純化抗體

文章內(nèi)容：

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CaptureSelect抗體親和填料集體亮相

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CaptureSelect技術(shù)是由Thermo Fisher Scientific開發(fā)的基于駱駝源單域抗體的專利技術(shù)（圖1），針對抗體、抗體片段等生物大分子藥物的純化而研制。CaptureSelect?技術(shù)是一種單域抗體技術(shù)，采用了美洲羊駝的免疫球蛋白中的重鏈可變區(qū)，VHH區(qū)作為配基，偶聯(lián)在POROS或者Agarose基質(zhì)上制成獨(dú)特的親和填料。CaptureSelect?親和配體與填料擁有獨(dú)特的穩(wěn)定性、親和性和選擇性，可用于抗體及抗體片段等生物大分子藥物的純化。

圖1.駱駝源單域抗體技術(shù)原理簡介。通過免疫美洲羊駝，產(chǎn)生免疫抗體，收集血清構(gòu)建表達(dá)庫并進(jìn)行篩選，篩選到的配體通過酵母表達(dá)，然后化學(xué)偶聯(lián)至瓊脂糖或POROS基質(zhì)上制成親和填料。

CaptureSelect?技術(shù)的優(yōu)勢:

可調(diào)節(jié)的特異性/親和力

無糖基化修飾的穩(wěn)定配體：12-15 kDa多肽

安全和良好的人耐受性

配體在酵母體系中高表達(dá)：完全無動物源

定制設(shè)計(jì)的親和配體連接在高性能層析介質(zhì)上

成熟的技術(shù)提供產(chǎn)品與工藝的特定親和解決方案

可用于臨床前生物藥物的開發(fā)

可用于商業(yè)化的生物治療工藝

CaptureSelect技術(shù)抗體類重要產(chǎn)品如下圖2，包括KappaXL，IgG-CH1，CH1-XL, FcXL和C-Tag親和填料。

圖2 CaptureSelect技術(shù)抗體類產(chǎn)品配基分類示意圖

多種親和填料為單抗和單抗類衍生產(chǎn)品提供純化方案

隨著單克隆抗體的研發(fā)深入和應(yīng)用逐漸廣泛之后，抗體片段（Fab、scFv及sdAb等）憑借分子結(jié)構(gòu)和分子量上的優(yōu)勢，能輕松的穿梭于組織之間；Fc融合蛋白是利用基因工程技術(shù)將具有活性功能的蛋白分子與抗體的Fc段融合所產(chǎn)生的新型功能蛋白?？贵w片段和Fc融合蛋白將會是繼抗體藥物后的下一個蛋白藥物研究熱點(diǎn)。

活動條款：

1. 活動促銷產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用，不得用于臨床診斷或治療。

2. 本次活動僅針對中國大陸的合格企事業(yè)單位用戶，任何經(jīng)銷商都不得參加以上所有活動，也不應(yīng)通過其他關(guān)聯(lián)公司參加，若獲得任何禮品將自動失效，不得領(lǐng)取。

Thermo Fisher Scientific 享有對本活動的最終解釋權(quán)，此規(guī)則同樣適用于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司

PS：現(xiàn)在在文末留言您與抗體純化的故事，被選入精選即可獲贈抗體公仔~

活動時間：

2017年12月1日至2018年03月31日

如果有任何問題請咨詢：

400-650-5118或800-810-5118

駱駝體內(nèi)存在天然的缺失輕鏈的重鏈抗體，克隆其可變區(qū)可以得到只有重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，也稱為納米抗體（nanobody, a single domain antibody），它是最小的功能性抗原結(jié)合片段。和普通抗體相比，納米抗體分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，易于進(jìn)行基因改造，體積小，抗原特異性好，組織穿透力強(qiáng)，穩(wěn)定性高，在疾病的診斷及治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。本文就納米抗體的結(jié)構(gòu)、建庫、淘選及應(yīng)用方面做簡要介紹。

1. 納米抗體與普通抗體的結(jié)構(gòu)及功能比較

感染或者免疫過的單峰駱駝的免疫反應(yīng)會產(chǎn)生普通的及僅有重鏈的抗體，這兩種類型的抗體均有與抗原結(jié)合的能力。重鏈抗體缺少普通抗體所有的CH1區(qū)域，且CDR1和CDR3要比VH長，這在一定程度上彌補(bǔ)了缺失輕鏈造成的抗原結(jié)合力下降的不足。二者結(jié)構(gòu)上差異如下圖所示：

普通的免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)是分子量為150 k Da的四聚體多肽，由兩對相同的重鏈（50 k Da）和輕鏈（25k Da）多肽組成，二者由鏈間的二硫鍵鏈接。輕鏈由N端的可變區(qū)（VL）和C端的一個保守的區(qū)域(CL)構(gòu)成。重鏈由四個或五個結(jié)構(gòu)域組成:N端的可變區(qū)（VH），緊接著三至四個恒定的區(qū)域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）。免疫球蛋白形成Y型或T型結(jié)構(gòu)，兩個抗原結(jié)合區(qū)域通過CH1及CH2間的柔性鉸鏈區(qū)連接在一起，連到負(fù)責(zé)起效應(yīng)的具有保守結(jié)構(gòu)的FC區(qū)域。在哺乳動物中這種免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)相對比較保守。

抗體的FC區(qū)域由重鏈的CH2及CH3構(gòu)成，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)（ADCC）及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC)。 抗體的N端，配對的VH及VL形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)（FV）,在輕、重鏈每個可變區(qū)中存在三個氨基酸長度及序列高度變異的區(qū)域，簡稱為CDR1,CDR2,CDR3, 這三個區(qū)域被四個序列相對保守的骨架區(qū)分隔開（FR1,FR2,FR3,FR4）。輕重鏈高變區(qū)通過非共價結(jié)合聚集成簇，形成大的界面與抗原結(jié)合，也即為抗體決定簇。這些超變的區(qū)域折疊成一些經(jīng)典的loop結(jié)構(gòu)。重鏈可變區(qū)的CDR3在長度及氨基酸組成上最多變，因此結(jié)構(gòu)也最難預(yù)測。

駱駝科血清中有普通的IgG1, 及重鏈抗體IgG2（約10 k Da）及IgG3（約12 k Da）。由于3’端CH1外顯子處剪切信號的點(diǎn)突變導(dǎo)致的可變剪接，造成重鏈抗體缺少能與輕鏈結(jié)合的CH1區(qū)域。IgG1分為IgG1a (鉸鏈區(qū)19個氨基酸) 和IgG1b (鉸鏈區(qū)12個氨基酸) IgG2分為IgG2a (鉸鏈區(qū)35個氨基酸) IgG2b (鉸鏈區(qū)29個氨基酸)IgG2c (鉸鏈區(qū)15個氨基酸)。IgG3 (鉸鏈區(qū)12個氨基酸)大約15 k Da, 分子量小，但擁有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)。

在序列上，脊椎動物中，普通抗體和納米抗體序列大部分相同，但存在五個保守位點(diǎn)氨基酸差異。Leu12Ser（即12位在VH中常為Leu, 而在VHH中此位常為Ser）, Val42Phe/Tyr, Gly49Glu, Leu50Arg/Cys, 和Trp52Gly（不是非常保守）。VH中42,49,50,52這四個位點(diǎn)主要參與與VL 作用，多為疏水的氨基酸，但在VHH中變成了親水的氨基酸，這種序列的改變增加了納米抗體的水溶性，減少了抗體的聚合性，也直接導(dǎo)致了VHH不能夠結(jié)合輕鏈。

在結(jié)構(gòu)上，CDR1由于突變熱點(diǎn)的存在（28位和30位），導(dǎo)致VHH向N端延長。VHH的CDR3 也較VH的長，大約為18個氨基酸，而人的VH常為14，鼠11個氨基酸。納米抗體僅有一個結(jié)構(gòu)域，不含傳統(tǒng)的連接肽序列。除了域內(nèi)保守的二硫鍵，VHH CDR3中的CYS還可以與CDR1或FR2中的CYS形成二硫鍵，這些增加的序列和loop結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了抗體與抗原結(jié)合的面積以及抗體的多樣性，同時導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，能夠耐受高溫及苛刻的極端環(huán)境。其次，納米抗體沒有傳統(tǒng)的Fc段，從而避免了Fc段引起的補(bǔ)體反應(yīng)。

納米抗體易于進(jìn)行基因操作，從而形成單價、雙價、雙特異及多價抗體，同時也能形成融合蛋白進(jìn)行靶向治療。如下圖所示。

納米抗體對人體免疫原性較弱，相容性好。 比較VH germline 序列及單峰駱駝germline 序列，前者大約50種，后者大約40種。駱駝的VHH胚系基因序列和人類VH3家族序列高度同源，因此對VHH進(jìn)行人源化比較簡單。

納米抗體分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，并由單一的基因編碼，因此在噬菌體、細(xì)菌及酵母中能大量表達(dá)。納米抗體具有強(qiáng)而快的穿透能力，利于它們進(jìn)入實(shí)體瘤中發(fā)揮作用，同時由于其能穿透血腦屏障，為腦部給藥提供了新方法。

2. 納米抗體庫的構(gòu)建

鑒于VHH 與VH的差異主要在于CH1區(qū)域的缺失，因此，建免疫和天然庫的工作重點(diǎn)在于從IgG中分離出缺少CH1的抗體?？梢酝ㄟ^一步或者二步PCR擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)。PCR的關(guān)鍵在于利用抗體骨架區(qū)的保守核苷酸序列來設(shè)計(jì)PCR引物。對于一步法PCR,可以擴(kuò)增從FR1到鉸鏈區(qū)序列，同時在引物上引入酶切位點(diǎn)。對于兩步法PCR，第一步PCR: Leader sequence to CH2的保守區(qū)。會產(chǎn)生兩種產(chǎn)物，VH（大約 850-900bp）及 VHH （大約550-600bp）。從PCR產(chǎn)物中分離出VHH。第二步 PCR: 以第一步PCR產(chǎn)物為模板，應(yīng)用可變區(qū)的FR1到FR4的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出VHH序列，同時也引入酶切位點(diǎn)方便下一步實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增出的抗體序列連接到載體上，其余的步驟同普通的構(gòu)建抗體庫的過程。具體流程見圖三。一般納米抗體庫容量可以比較容易達(dá)到10e8或10e9，多樣性大于95%。同時由于VHH只有一個可變區(qū)，庫容在10e6時也能篩選到特異性抗體。但是在普通的抗體Fab 或者ScFv庫中，需要庫容足夠大才能更容易地篩選得到抗體。

圖三：納米抗體庫的構(gòu)建及納米抗體的淘選

3. 納米抗體的淘選

納米抗體的淘選和普通抗體的淘選比較類似，可以通過噬菌體展示的方法，淘選到抗原特異性抗體。將普通抗原固定在固相支持的載體上，經(jīng)過封閉，結(jié)合，洗脫，擴(kuò)增等階段富集抗原特異性抗體。一般通過2-3輪淘選即可篩選到特異性抗體。同時也可以在液相中淘選，利用SA包被的磁珠與生物素標(biāo)記的抗原間的特異性結(jié)合，也經(jīng)過封閉，結(jié)合，洗脫，擴(kuò)增等步驟得到抗原特異性抗體。除了普通的蛋白淘選，也可以用表達(dá)特異性抗原的細(xì)胞進(jìn)行淘選，大體步驟也同蛋白淘選。

為了提高淘選得到蛋白的親和力，在每輪淘選時可以連續(xù)降低抗原的濃度或者細(xì)胞的量，同時逐步增加洗滌的次數(shù)。在封閉時加入一些陰性對照蛋白或者細(xì)胞能提高淘選到的抗體的特異性。

淘選得到的抗體依載體的不同，可以表達(dá)在上清或者細(xì)胞周質(zhì)里，通過ELISA或者FACS驗(yàn)證抗體與抗原的結(jié)合能力。為了下游動物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，需要篩選到人、鼠、猴三陽的抗體。

4. 納米抗體的應(yīng)用

納米抗體能用于構(gòu)建多重不同類型的分子結(jié)構(gòu)，在醫(yī)學(xué)診斷和治療上實(shí)用性較高。例如可以構(gòu)建成雙功能抗體或雙特異性抗體進(jìn)行疾病的靶向治療。雙特異性抗體可以識別一個靶抗原的相鄰兩個位點(diǎn)，獲得對抗原的高親和性，也可以識別不同的抗原，如腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面的抗原，達(dá)到治愈疾病的目的。與普通的雙特異性抗體相比，它們分子量小，水溶性及穩(wěn)定性高，表達(dá)量也普遍較高。

通過基因改造，納米抗體可以形成多聚體，大大提高了抗體與抗原的結(jié)合能力。通過基因工程形成納米抗體融合蛋白可以帶上酶或者毒素，融合蛋白在組織穿透，清除速度及穩(wěn)定性上比普通抗體更有優(yōu)勢，可以用于低濃度抗原的檢測。

由于納米抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，也可應(yīng)用于蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究中。納米抗體形成的蛋白復(fù)合物能穩(wěn)定抗原，保持其晶體結(jié)構(gòu)，是研究不穩(wěn)定的蛋白良好載體。

納米抗體也能作為胞內(nèi)抗體發(fā)揮作用。大部分抗體在細(xì)胞內(nèi)沒有功能，因?yàn)樵诩?xì)胞質(zhì)還原環(huán)境中不能形成二硫化合物，或者靶向亞細(xì)胞部位比較困難，但納米抗體通常比較穩(wěn)定，甚至在胞質(zhì)中能維持其抗原結(jié)合能力。

5. 小結(jié)

納米抗體發(fā)展到現(xiàn)在，已經(jīng)擁有廣泛的應(yīng)用價值，由于分子量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，容易進(jìn)行基因改造，生產(chǎn)成本低，易于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，因此，納米抗體在疾病治療和診斷及腫瘤的靶向診斷和治療中具有很大的發(fā)展機(jī)遇。