沼氣發(fā)酵實驗教程

第一篇沼氣發(fā)酵工藝參數(shù)的測定

實驗1沼氣發(fā)酵原料和料液的總固體（TS）含量測定2

實驗2原料和料液的揮發(fā)性固體（VS）含量和灰分測定5

實驗3溶解氧（DO）測定——碘量法7

實驗4CODCr測定11

實驗5BOD5的測定15

實驗6總有機碳（TOC）的測定21

實驗7氨態(tài)氮（NH 4N）的測定26

實驗8總氮（N）素的測定30

實驗9磷和總磷的測定36

實驗10鈣（Ca2 ）的測定——EDTA滴定法46

實驗11鉀（K ）的測定——四苯硼鈉法53

實驗12鐵（Fe）的測定——鄰菲啰啉比色法61

實驗13氧化還原電位測定法68

實驗14沼氣發(fā)酵原料和料液的pH值測定73

實驗15產(chǎn)CH4菌的MPN法計數(shù)77

實驗16燃燒熱測定81

參考文獻87

第二篇沼氣發(fā)酵中基礎物質(zhì)及相關活性生物物酶測定

實驗17還原糖與總糖的分析測定94

實驗18淀粉分解酶的測定分析104

實驗19蔗糖酶的測定分析111

實驗20半纖維素的分離提取與分析測定114

實驗21半纖維素酶（木聚糖酶）的分析測定127

實驗22纖維素的分析測定139

實驗23纖維素降解酶的分析測定145

實驗24木質(zhì)素的分離提取與分析測定153

實驗25木質(zhì)素降解酶的分析測定165

實驗26脫氫酶的分析測定186

實驗27蛋白質(zhì)與蛋白酶的分析測定193

實驗28沼氣發(fā)酵中氣體成分測定方法202

參考文獻204第三篇沼氣發(fā)酵實驗

實驗29農(nóng)作物秸稈及畜禽糞便批量發(fā)酵實驗214

實驗30農(nóng)作物秸稈及畜禽糞便連續(xù)發(fā)酵實驗217

實驗31厭氧污泥的產(chǎn)甲烷活性測定221

實驗32厭氧生物可降解性測定226

實驗33產(chǎn)甲烷毒性的測定230

實驗34反應器內(nèi)污泥量的測定237

實驗35生物化學甲烷勢的測定239

實驗36UASB反應器處理有機廢水實驗240

參考文獻244

雖然早在1630年比利時布魯塞爾的醫(yī)生Van Helment就已經(jīng)認識到了沼氣，但對沼氣發(fā)酵的科學認識卻始于1901年。百年來，沼氣的發(fā)展十分迅速，沼氣微生物的研究從技術方法、群體代謝、個體水平到分子生物學、基因研究、Methanococcus jannaschii全基因組序列的測定，沼氣發(fā)酵從工藝過程到設備配套技術，沼氣技術的應用從廢棄物能源利用到環(huán)境和生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展等方面均取得了長足的發(fā)展。

在產(chǎn)甲烷菌的研究方面，個體產(chǎn)甲烷菌的分類地位逐漸提高，短短幾十年，產(chǎn)甲烷菌由一個科上升至5目、10科、26屬；對產(chǎn)甲烷菌細胞壁結(jié)構、膜質(zhì)成分、16S rRNA親緣關系、7種輔酶因子形成甲烷的機制等的揭示，改變了種系發(fā)生的傳統(tǒng)二分法理論，提出了生命三領域?qū)W說(Three Domains Theory)：古核生物(arachaea)、細菌(bacteria)和真核生物(eucarya)。在沼氣發(fā)酵的工藝方面，從簡單的沼氣發(fā)生器出現(xiàn)后，先后又提出和發(fā)展了一系列工藝技術，如高速消化器、厭氧接觸消化器、UASB、AF、兩相厭氧消化器、厭氧流化床和厭氧膨脹床等，這些技術的開發(fā)和應用拓寬了厭氧消化技術的服務范圍，大大提高了厭氧消化的效率。從能源的開發(fā)與利用來看，沼氣技術利用有機廢棄物生產(chǎn)能源，即在有效治理有機污染的同時開發(fā)清潔能源；這種能源開發(fā)利用方式能夠保持大氣中二氧化碳的循環(huán)，或二氧化碳零排放。

沼氣發(fā)酵系統(tǒng)涉及內(nèi)容廣泛，理論、應用與實踐共同發(fā)展，多學科交叉與滲透十分突出，沼氣的推廣應用涉及多部門間的合作與協(xié)調(diào)。既有基礎微生物學、分子生物學研究，又有發(fā)酵工程的內(nèi)容；既有工藝學的研究，又有工程的建筑與設計；既有微生物代謝與代謝產(chǎn)物的研究，又有沼氣發(fā)酵殘留物的各種綜合利用；既有廢物的處理與能源利用，又有環(huán)境與生態(tài)工程的實踐；既有以沼氣為紐帶的可持續(xù)農(nóng)業(yè)理論探索，又有各種生態(tài)農(nóng)業(yè)模式的涌現(xiàn)；既有農(nóng)村家用沼氣池的應用，又有大中型沼氣工程的運行；既有禽畜場大中型沼氣工程、工廠有機廢水處理沼氣工程，又有城鎮(zhèn)生活污水沼氣凈化工程。

沼氣發(fā)酵是生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化的有效形式之一，特別是對于解決農(nóng)村能源以及治理有機廢物和廢水環(huán)境污染等問題具有重要的作用。我國農(nóng)村沼氣30多年來的實踐表明，沼氣在解決我國農(nóng)村能源方面發(fā)揮著積極的甚至是不可替代的作用；以沼氣為紐帶的生態(tài)農(nóng)業(yè)建設，取得了長足的發(fā)展，南方“豬沼果”、北方“四位一體”、西北“五配套”生態(tài)模式有力地促進了農(nóng)村經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展；“三結(jié)合”、“一池三改”的農(nóng)村沼氣建設，改善了農(nóng)村環(huán)境衛(wèi)生，整治了村容村貌，有效地促進了新農(nóng)村的建設。我國農(nóng)村沼氣建設成功的經(jīng)驗已被世界所認識，在發(fā)達國家資金的扶持下，發(fā)展中國家農(nóng)村沼氣建設正在蓬勃發(fā)展，2008年荷蘭政府啟動了非洲沼氣行動計劃，荷蘭政府在全球籌資20億歐元，將用十年的時間在非洲建設200萬個農(nóng)村家用沼氣池；亞洲銀行出資，其中2/3是補助資金，1/3是貸款，支持亞洲發(fā)展150萬個農(nóng)村家用沼氣池。

20世紀80年代以來厭氧消化技術應用于有機廢水的處理，各種厭氧消化工藝趨于成熟和高效，在污水處理方面發(fā)揮著越來越重要的作用。面對養(yǎng)殖場大量的糞便廢水，最有效的處理方法就是厭氧消化，這種處理方式實現(xiàn)了糞便廢水的資源化利用，在環(huán)境污染的治理中獲得較好的經(jīng)濟收益。以沼氣工程為紐帶，將污染治理轉(zhuǎn)化為資源開發(fā)的優(yōu)勢，用環(huán)保治理拉動企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，使環(huán)保產(chǎn)業(yè)作為產(chǎn)業(yè)建立的基礎，建立飼料(feed)、肥料(fertilizer)、食品(food)和能源/燃料(fuel)的4F循環(huán)經(jīng)濟模式，最終獲得能源、社會、生態(tài)/環(huán)境和經(jīng)濟四大效益，實現(xiàn)區(qū)域的可持續(xù)發(fā)展。

截至2011年底，全國戶用沼氣達到3996萬戶，占鄉(xiāng)村總戶數(shù)的23%，受益人口達15億多人；中央支持建成了24萬處小型沼氣工程和3690多處大中型沼氣工程，多元化發(fā)展的新格局初步形成；全國鄉(xiāng)村服務網(wǎng)點達到9萬個、縣級服務站800多個，服務沼氣用戶3000萬戶左右，覆蓋率達到75%，以沼氣設計、沼氣施工、沼氣服務、沼氣裝備和“三沼”綜合利用為主要內(nèi)容的產(chǎn)業(yè)化體系初步建立。農(nóng)村沼氣從小工程做成了大產(chǎn)業(yè)，把小環(huán)境變成了大生態(tài)，由小項目形成了大事業(yè)。通過發(fā)展農(nóng)村沼氣，有效防止和減輕了畜禽糞便排放和化肥農(nóng)藥過量施用造成的面源污染，對實現(xiàn)農(nóng)業(yè)節(jié)本增效、循環(huán)發(fā)展，提高農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力和競爭力發(fā)揮了重要作用；增強了應對氣候變化和保障能源安全的能力，對減少化石能源消耗、改善農(nóng)村用能結(jié)構和應對氣候變化發(fā)揮了不可替代的作用；實現(xiàn)了糞便、秸稈、有機垃圾等農(nóng)村主要廢棄物的無害化處理、資源化利用，使困擾新農(nóng)村建設的諸多“臟亂差”環(huán)境問題得到了有效解決，提高了農(nóng)民生活質(zhì)量，改善了農(nóng)業(yè)農(nóng)村生產(chǎn)生態(tài)環(huán)境，成為了新時期重要的農(nóng)村民生工程和新農(nóng)村建設的一大亮點。

目前，許多大專院校的農(nóng)業(yè)工程專業(yè)，均開設了沼氣技術相關的課程，而沼氣技術本身是一門實驗與實踐較強的專業(yè)課，從課程建設來看，國內(nèi)沒有一本關于沼氣實驗方面的教材，我們將多年碩士研究生的教學實驗進行整理，并參考相關書籍編寫了《沼氣發(fā)酵實驗教程》。該書具有較強的專業(yè)特色，主要是針對碩士研究生專業(yè)學習與完成研究論文而編寫，同時兼顧相關生物質(zhì)能專業(yè)的本科生學習與基本技能訓練，對相關專業(yè)的博士研究生也具有資料豐富性、內(nèi)容新穎性和思考題啟發(fā)性的參考價值。應用該書的人員除具備一定的化學基礎外，還需具備一定的生物化學與微生物學基礎知識。每個實驗是一個相對獨立的整體，思考題則多以具體研究設計形式出現(xiàn)，要求理論與實際相結(jié)合，用提示的方式給出現(xiàn)階段技術可行的參考方法與思考。該書不僅是碩士研究生與本科生教學的參考用書，對于高等院?？蒲性核目萍既藛T與博士研究生也有參考價值和一定的指導意義?？晒氖律镔|(zhì)能和環(huán)境治理以及農(nóng)、林、牧行業(yè)的相關研究與開發(fā)人員借鑒。

雖然《沼氣發(fā)酵實驗教程》是根據(jù)多年的教學經(jīng)驗總結(jié)而成，并參考了大量的文獻資料，但終因水平有限，疏漏之處一定不少，懇請讀者批評指正。

張無敵于云南師范大學

2013年8月2100433B

1.該書是全國農(nóng)業(yè)工程方面、生物質(zhì)沼氣利用方面的首部沼氣發(fā)酵實驗教程.

2.內(nèi)容包括沼氣發(fā)酵中的各種實驗，對研究生、本科生及生物質(zhì)能等利用開發(fā)人員有較好的參考作用。

沼氣發(fā)酵是一個復雜的生物化學過程，具有以下特點 ：

（1）參與發(fā)酵反應的微生物種類繁多，沒有應用單一菌種生產(chǎn)沼氣的先例，在生產(chǎn)和試驗過程中需要用接種物來發(fā)酵。

（2）用于發(fā)酵的原料復雜，來源廣泛，各種單一的有機質(zhì)或混合物均可作為發(fā)酵原料，最終產(chǎn)物都是沼氣。此外，通過沼氣發(fā)酵能夠處理COD質(zhì)量濃度超過50000mg/L的有機廢水和固體含量較高的有機廢棄物。

（3）沼氣微生物自身能耗低，在相同的條件下，厭氧消化所需能量僅占好氧分解的1/30~1/20。

（4）沼氣發(fā)酵裝置種類多，從構造到材質(zhì)均有不同，但各種裝置只要設計合理均可生產(chǎn)沼氣。

（5）產(chǎn)甲烷菌要求在氧化還原電位-330mV以下的環(huán)境生活，沼氣發(fā)酵要求在嚴格的厭氧環(huán)境中進行。

沼氣發(fā)酵是指各種固態(tài)的有機廢物經(jīng)過沼氣微生物發(fā)酵產(chǎn)生沼氣的過程。一般可大致分為三個階段 ：

沼氣發(fā)酵液化階段

由于各種固體有機物通常不能進入微生物體內(nèi)被微生物利用，因此必須在好氧和厭氧微生物分泌的胞外酶、表面酶（纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶）的作用下，將固體有機質(zhì)水解成相對分子質(zhì)量較小的可溶性單糖、氨基酸、甘油、脂肪酸。這些相對分子質(zhì)量較小的可溶性物質(zhì)就可以進入微生物細胞之內(nèi)被進一步分解利用。

沼氣發(fā)酵產(chǎn)酸階段

各種可溶性物質(zhì)（單糖、氨基酸、脂肪酸），在纖維素細菌、蛋白質(zhì)細菌、脂肪細菌、果膠細菌胞內(nèi)酶作用下繼續(xù)分解轉(zhuǎn)化成低分子物質(zhì)，如丁酸、丙酸、乙酸以及醇、酮、醛等簡單有機物質(zhì)；同時也有部分氫、二氧化碳和氨等無機物的釋放。但在這個階段中，主要的產(chǎn)物是乙酸，約占70%以上，所以稱為產(chǎn)酸階段。參加這一階段的細菌稱為產(chǎn)酸菌。

沼氣發(fā)酵產(chǎn)甲烷階段

由產(chǎn)甲烷菌將第二階段分解出的乙酸等簡單有機物分解成甲烷和二氧化碳，其中二氧化碳在氫氣的作用下還原成甲烷。這一階段稱為產(chǎn)氣階段，或稱為產(chǎn)甲烷階段。

一般認為，從各種復雜有機物的分解開始到最后生成沼氣，共有五大生理類群的細菌參與，它們是發(fā)酵性細菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌、食氫產(chǎn)甲烷菌和食乙酸產(chǎn)甲烷菌。五群菌構成一條食物鏈，根據(jù)其代謝產(chǎn)物的不同，前三群細菌共同完成水解酸化過程，后兩群細菌完成產(chǎn)甲烷過程。

沼氣發(fā)酵發(fā)酵性細菌

可用于沼氣發(fā)酵的有機物種類繁多，如禽畜糞便、作物秸稈、食物及酒精加工廢物等，其主要化學成分包括多糖類（如纖維素、半纖維素、淀粉、果膠質(zhì)等）、脂類和蛋白質(zhì)。這些復雜有機物大多不溶于水，必須首先被發(fā)酵性細菌所分泌的胞外酶分解為可溶性的糖、氨基酸和脂肪酸后，才能被微生物吸收利用。發(fā)酵性細菌將上述可溶性物質(zhì)吸收進入細胞后，經(jīng)發(fā)酵作用將其轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸和醇類，同時產(chǎn)生一定量的氫氣及二氧化碳。沼氣發(fā)酵時發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸的總量稱為總揮發(fā)酸（TVA）。在發(fā)酵正常的情況下，總發(fā)揮酸中以乙酸為主。蛋白類物質(zhì)分解時，除生成產(chǎn)物外，還會有氨額硫化氫產(chǎn)生。參與水解發(fā)酵過程的發(fā)酵性細菌種類繁多，已知的就有幾百種，包括梭狀芽孢桿菌、擬桿菌、丁酸菌、乳酸菌、雙歧桿菌和螺旋菌等。這些細菌多數(shù)為厭氧菌，也有兼性厭氧菌。

沼氣發(fā)酵產(chǎn)甲烷菌

在沼氣發(fā)酵過程中，甲烷的形成是由一群高度專業(yè)化的細菌—產(chǎn)甲烷菌引起的。產(chǎn)甲烷菌包括食氫產(chǎn)甲烷菌和食乙酸產(chǎn)甲烷菌，它們是厭氧消化過程食物鏈中的最后一組成員，盡管它們具有各種各樣的形態(tài)，但它們在食物鏈中的地位使它們具有共同的生理特性。它們在厭氧條件下將前三群細菌代謝的終產(chǎn)物，在沒有外源受氫體的情況下，把乙酸轉(zhuǎn)化為氣體產(chǎn)物甲烷和二氧化碳，使有機物在厭氧條件下的分解作用得以順利完成。 2100433B